Sequenciamento de DNA por terminação reversível cíclica

Sequenciamento por terminação reversível cíclica: após o enriquecimento do molde em fase sólida, uma mistura de primers, DNA polimerase e nucleotídeos modificados é adicionada à célula de fluxo. Cada nucleotídeo é bloqueado por um grupo 3’‑O‑azidometil e é marcado com um fluoróforo de clivagem específico para cada base. Durante cada ciclo, fragmentos em cada grupamento irão incorporar apenas um nucleotídeo, pois o grupo 3’ bloqueado impede incorporações adicionais. Após a incorporação da base, as bases não incorporadas são lavadas e a lâmina é visualizada por microscopia de reflexão de fluorescência interna total, usando 2 ou 4 canais de laser; a cor (ou a falta ou mistura de cores no sistema de dois canais) identifica qual base foi incorporada em cada grupamento. O fluoróforo é, então, clivado e o 3’-OH é regenerado com o agente redutor tris (2-carboxietil) fosfina. O ciclo de adição, alongamento e clivagem de nucleotídeos pode começar de novo. Fonte: adaptada de Goodwin S, McPherson JD, McCombie WR. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016 ;17(6):333-51.